ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Студенти кафедри біохімії для дослідницької роботи направляються на різні науково-дослідні інститути, а також можуть займатися в лабораторіях кафедри. Моя робота проходить в лабораторії "Регуляція експресії генів" Інституту цитології РАН. Безпосередньо моя наукова діяльність не пов'язана з тваринами і в основному мені доводиться мати справу з культурами клітин ссавців або бактеріальних клітин. Більшу ж частину часу відводиться на роботу з ще більш дрібними об'єктами - молекулами нуклеїнових кислот і білків. Дослідження нашої групи пов'язані з вивченням ролі продукту гена ретинобластоми (pRb) у регуляції клітинного циклу. Більшість клітин на тому чи іншому етапі свого розвитку зазнають поділ, тобто проходять через фази клітинного циклу. Вперше білок pRb був описаний у зв'язку з мутацією кодує його гена в трансформованих (тобто які стали злоякісними) клітинах сітківки ока. Саме з відсутністю даного білка пов'язані пухлини цієї тканини (ретинобластоми), а також, як з'ясувалося згодом, і інших тканин. Білок pRb експресується у всіх еукаріотичних організмів - від дріжджів до людини і у всіх виконує роль супресора (негативного регулятора) клітинного циклу. Саме тому ми вважаємо, що вивчення закономірностей в клітинному циклі, розгляд механізмів його регулювання і являє собою дуже важливу і цікаву область клітинної біології.
У своїй науковій роботі ми використовуємо різні інструменти і методи дослідження - від світлової мікроскопії до радіоактивних ізотопів. Знаходять застосування також різні електричні прилади та обчислювальні машини - від калькулятора до комп'ютерів. Безпосередньо моя робота пов'язана, як правило, з одержанням рекомбінантних молекул ДНК і подальшим використання їх в різноманітних цілях.
Необхідно відзначити, що адміністрацією Інституту цитології передбачені правила безпечної роботи з рекомбінантними молекул ДНК. Ці правила включають заходи безпеки і фізичні заходи захисту.
Заходи безпеки складаються з прийомів стандартної мікробіологічної практики, фізичного і біологічного захисту. Відповідно до правил до роботи з рекомбінантними ДНК допускаються особи, які пройшли медичний огляд і отримали підготовку, що передбачає знання основ біології організмів, з якими доведеться працювати, і прийомів роботи з ними. Підготовка повинна бути підтверджена документально.
Фізичні заходи захисту поділяються на кілька рівнів.
Мінімальний рівень (Ф1)
Експерименти, що вимагають фізичного захисту першого рівня, можуть проводиться в лабораторії, призначеної для роботи з мікроорганізмами ряду Escherichia (штам E. Coli K-12) за допомогою відомих і загальноприйнятих мікробіологічних методів. Робота проводиться на відкритих поверхнях без спеціального захисного обладнання. У лабораторії повинна підтримуватися сувора чистота. Прийом і зберігання їжі, куріння в цьому приміщенні заборонені. Слід використовувати для роботи тільки механічні піпетки. У лабораторії Ф1 проводять всі експерименти з клонування фрагментів ДНК прокаріотів і еукаріотичного напрямку.
Низький рівень (Ф2)
Експерименти, в яких необхідна фізичний захист вторгся рівня, можуть проводитися в приміщеннях, подібних до лабораторії Ф1, проте доступ сторонніх осіб до лабораторії обмежується. Автоклав (паровий стерилізатор) встановлюється в тому ж будинку, де розташована лабораторія. Рекомендується використання боксів з ламінарним потоком повітря та інші пристрої фізичного захисту, що зводять до мінімуму небезпеку витоку матеріалів. Використані в досвіді матеріали, що містять мікроорганізми, знезаражуються. Під час роботи на дверях лабораторії вивішується знак біологічної небезпеки. Застосовуються усі прийоми, обов'язкові для Ф1. У лабораторії Ф2 проводяться експерименти з маніпуляції з генами тварин і людини, які можуть нести потенційну біологічну небезпеку (у тому числі з онкогенами на основі клітин E. Coli K-12 і векторів типу pBR322, pUC та ін).
Середній рівень (Ф3)
Експерименти, що вимагають фізичного захисту третього рівня, проводяться в лабораторії, що має спеціальні інженерні конструкції та захисне обладнання, а також автономне обладнання: автоклав, СО2 інкубатор, центрифуги, термостати. Лабораторія відділяється від інших приміщень дверима з блокуванням, що забезпечують герметичність. Поверхні стін, підлог, столів і стель повинні ретельно очищатися і деконтамініроваться. Всередині лабораторії створюється негативний тиск. Повітря з лабораторії надходить за її межі з самостійним повітроводам після попереднього очищення на фільтрах. Роботи, що проводяться в лабораторії Ф3 включають експерименти на клітинах тварин і людини, трансформованих онкогенами і ретровірусами, що містять різні гени, в тому числі онкогени. На дверях лабораторії, обладнанні і матеріалах встановлюється знак біологічної небезпеки.
Вхід в лабораторію Ф3 дозволяється тільки тим особам, чия присутність передбачено програмою досліджень і затверджено комісією інституту з рекомбінантним ДНК.
Працюючі повинні користуватися засобами індивідуального захисту відповідно до норм їх безплатної видачі.
Безпосередньо після роботи робочі поверхні боксів та іншого обладнання знезаражуються, скляний посуд стерилізується безпосередньо в лабораторії.
Високий рівень Ф4 - в Інституті цитології РАН не передбачається.
УМОВИ ПРАЦІ під час лабораторних досліджень

ОБЛАДНАННЯ
Для виконання наукової роботи я користуюся таким обладнанням:
- Термостат (температура до 85С)
- Настільна мікроцентріфуга (максимальна швидкість - 12000 об/хв)
- Центрифуги К-23 і К-24 (максимальна швидкість - 15000 об/хв)
- Камери для проведення гель-електрофорезу
- Трансіллюмінатор
- Апарат для блот
- Електрична плитка

Реєстрація результатів проводиться за допомогою траніллюмінатора, звичайних ламп розжарювання та фотоапарата. У зв'язку з цим, певна частина робочого часу проходить у фотокомнатах.
Трансіллюмінатор являє собою прилад, що складається з ламп, що випускають ультрафіолетове світло і кварцового скла (таке скло використовується, оскільки воно пропускає ультрафіолетові промені). Так як випромінювання в ультрафіолетовому діапазоні є небезпечним для ока, то спостереження ведеться тільки в спеціальних окулярах, пристосованих для цих цілей. Ультрафіолетовий світло застосовується з метою детекції фрагментів ДНК, розділених в агарозном гелі і пов'язаних зі спеціальним барвником - бромистим етидій, який поглинає світло в зазначеному діапазоні. Завдяки цьому стає можливим спостереження фрагментів ДНК і визначення їх розмірів, а також отримання їх у препаративних кількостях для подальшого використання.
Камери для електрофорезу представляють собою ємності певної конфігурації, в які поміщається гель, а потім заливається буфер, що містить рухомі заряджені частинки - іони. Завдяки такій конструкції забезпечується рухливість фрагментів нуклеїнових кислот або білків в гелях та їх розподіл з суміші. Поділ проводиться при силі струму до 50 мА і напрузі до 100 V.
Пристрій для перенесення (блот) складається з двох платинових пластин, поміщених в ізолюючу камеру. Параметри електричного струму при переносі не перевершують зазначених для гель-електрофорезу.
Використовується термостати двох типів - повітряний і водяний. Температура в повітряному термостаті не перевищує 37С, а у водяному - 85С.
Роботи проводяться на лабораторному столі. Застосовується штучне освітлення робочої зони побутовими лампами розжарювання потужністю 100 W. При обробці отриманих у ході досліджень даних використовується персональний комп'ютер.
Слід зазначити, що оскільки різне устаткування, що використовується в роботі, в силу своїх природних габаритів і функціонального призначення розташовується на різних поверхах будинку інституту. Тому досить часто робоча зона приймає досить значні розміри (з 1-го по 3-й поверх). Особливо великі незручності це заподіює, коли з метою економії електроенергії, ліфти знеструмлюють, починаючи з 16 години, що дозволяє віднести роботу в цей час до категорії IIб. В інший час робота відноситься, як видно, до категорії легких.

СХЕМА ПРИМІЩЕНЬ

Шкідливий фактор
ЕЛЕКТРИЧНИЙ ТОК
У своїй роботі ми використовуємо різноманітні прилади, які живляться від електромережі. Гель-електрофорез проводиться при силі струму до 50 мА і напрузі до 100 V. Всі контакти при цьому надійно ізольовані. Які проводять струм поверхні є лише в апараті для переносу (блот), проте вони укладені в ізолюючу камеру, що виключає контакт з нею під час блот.

ІОНІЗУЮЧОГО й електромагнітне випромінювання
Джерелом таких випромінювань є монітор персонального комп'ютера. У принципі він випромінює електромагнітні хвилі наднизької частоти, м'яке рентгенівське випромінювання. Однак монітор, в даний час використовується в нашій лабораторії володіє низькою інтенсивністю випромінювання і відповідає світовому рівню (LR - "Low Radiation"). Крім того, час безперервної роботи з комп'ютером не перевищує, як правило, однієї години.

ОСВІТЛЕННЯ
При роботі з комп'ютером для підвищення контрасту зображення і усунення відблисків екрану використовується екранний фільтр. Крім того, монітор підтримує режим порядкової розгортки "NI" і стабілізації зображення для зниження стомлюваності очей під час роботи.
За нормативами СНиП II-4-79 мінімальна освітленість робочої поверхні в цьому випадку повинна бути 300-400 лк при комбінованому освітленні. У приміщенні для загальних робіт освітлення створюється п'ятьма верхніми люстрами по 2 лампи денного світла кожна і настільними лампами на гнучких власниках, що дозволяють направляти світло в потрібну точку столу. Дана система є цілком адекватною і раціональною.

Шуми, ЗВУКИ і вібрації
Основними джерелами шумів і вібрацій є центрифуги та шейкери. Центрифуги К-23 і К-24 знаходяться в спеціальному приміщенні, ізольованому і допускає лише короткочасне перебування людей. Що стосується мікроцентріфугі, то вона використовується, в основному, в ізольованому приміщенні з постійною температурою від 4 до 8С ( "холодна кімната"). Те ж стосується і шейкером, з одним застереженням, що їх доводиться застосовувати настільки ж часто і в ізольованому приміщенні з температурою 37С.

ХІМІЧНІ ФАКТОРИ
Хімічні речовини є джерелом найбільшої небезпеки при роботі в нашій лабораторії. Для своєї діяльності я використовую наступні отруйні речовини: лугу (NaOH і KOH) і кислоти (HCl і H3РO4), хлороформ, метанол, фенол, вже згадуваний бромистий етидій та інші.
Метанол - сильний, переважно нервовий і судинний отруту. В організм людини може надходити через органи дихання, шлунково-кишковий тракт і непошкоджену шкіру.
Луги і кислоти при впливі на організм людини викликають:
- Подразнення слизових оболонок очей і верхніх дихальних шляхів
- Дерматити, екземи
- Коагуляційний некроз тканинних білків
- Ураження очей (можлива повна втрата зору)
- Ураження печінки, нирок, шлунково-кишкового тракту, серцево-судинної системи, легень
Ступінь ураження залежить від концентрації, температури і часу впливу. Фенол є високотоксичною речовиною і при попаданні на шкіру викликає опіки. Вдихання парів фенолу навіть у дуже невеликих концентраціях супроводжується роздратуванням і при великих дозах - поразкою слизових оболонок очей, носа, горла і т.д., а також дихальних шляхів і легенів.
Бромистий етидій має сильний мутагенним дією.

Слід зазначити, що далеко не завжди повністю дотримуються правила роботи з кожним із цих речовин. Пов'язано це не зі зневагою правилами, а з фактичною неможливістю їх виконання. Наприклад, метанол повинен відпускатися зі складу в лабораторію в кількості, що не перевищує добової потреби. Ця вимога, на жаль, не може бути задоволена в зв'язку з труднощами при отриманні речовин зі складу (постійної їх браком і т.д.), а також з самим режимом роботи складу (одержання речовин зі складу вимагає попереднього оформлення та тривалого очікування).
Тим не менше, робота з вказаними речовинами проводиться у витяжній шафі і в рукавичках і з дотриманням всіх запобіжних засобів. Речовини, які не потребують зберігання при низькій температурі (луги, кислоти, тощо), зберігаються також у витяжній шафі.

МІКРОКЛІМАТ
Дослідження я проводжу в холодний і перехідний періоди року, тому нормою в даному випадку є умови: температура повітря на постійному робочому місці - 16-21С, швидкість руху повітря не більше 0,2 м/с, температура повітря поза робочим місцем - 14-20 ° С. У будинку діє централізоване парове опалення, однак із-за малої потужності фактично не виконується жодна температурна норма навіть після ретельного обклеювання вікон. Будівля Інституту цитології в зимовий час опалюється, однак у зв'язку зі своєрідною конструкцією або з інших невідомих причин, температура в кімнаті взимку буває рівною 12-15С.

Заходи, що вживаються щодо нормалізації обстановки з отруйними
хімічними речовинами та мікроклімату:
Для збільшення безпеки роботи з отруйними речовинами, вони зберігаються у спеціально відведеному для цієї мети шафі в підсобному приміщенні, що надійно закривається і перебування людей в якому обмежена.
Для більш безпечної роботи з бромистим етидій, він не додається в буфер для електрофоретичного поділу, а включається до складу гелю, що значно зменшує обсяг забрудненого речовини і полегшує його елімінацію.
Аналогічно, для переносу (блот) білків на мембрану з нітроцелюлози, в даний час використовується метод "напівсухого" перенесення, до якого потрібно дуже невелика кількість буфера (в порівнянні з традиційними методами), до складу якого входить метанол; крім того перенесення цим методом займає значно менше часу. Це також сприяє зменшенню контакту співробітників з отруйними речовинами і зниження шкідливих відходів при видаленні використаного речовини.
Для підвищення температури на робочому місці холодний період нами застосуються електронагрівачі рефлекторного типу. Це, звичайно, підвищує пожежонебезпечність, але іншого виходу в наших умовах не залишається, і на це йдуть, звертаючи при цьому підвищену увагу на пожежну безпеку. Після досягнення в кімнаті температури, що відповідає комфортному клімату, прилади вимикаються. Останній рік, що минає в кінці робочого дня відключає групові щитки розеток і залишає запис у журналі чергового по кімнаті.

ЛІТЕРАТУРА

Мілохов В.В., Єгоров Е.М., Аксьонов А.А. Охорона праці: Навчальний
пособие .- Л: Изд-во Ленінградського університету, 1983. 112 с.

Правила безпечної роботи з рекомбінантними молекулами ДНК

Інструкція # 1 з охорони праці під час отримання, зберігання та видачі метанолу
у підрозділах Інституту цитології РАН

Інструкція # 3 з техніки безпеки при роботі з органічними речовинами

Інструкція # 12 з техніки безпеки при проведенні робіт з
використанням кислот і лугів у підрозділах Інституту цитології РАН

9