Елементи методу капілярного електрофорезу

К.ф.-м.н. Ягов Г.В.

Вступ

Досвід сучасної науки показує, що поєднання здавалося б протилежних властивостей призводить до отримання нових, несподіваних результатів. Саме таке поєднання властивостей води (водних розчинів електролітів) і "каменю" (діоксиду кремнію, кварцу, з якого виготовлений капіляр), дозволили створити новий метод аналізу, який носить назву капілярного електрофорезу (КЕФ). Власне і електрофорез і капілярність були відомі досить давно, але тільки кілька десятиліть тому вдалося розробити новий метод аналізу, в якому ці явища використовуються для розділення проб складного складу на складові частини.

На сьогоднішній день капілярний електрофорез є одним з найбільш перспективних методів аналізу, він динамічно розвивається і набуває все більш широке застосування в різних галузях аналітичної хімії. Простота і доступність цього методу, а також незаперечні переваги, які він дає час виконання вимірювань, дозволяють сподіватися на динамічний розвиток методичного забезпечення та якнайшвидше включення капілярного електрофорезу в перелік фізико-хімічних методів аналізу, найбільш часто вживаних у повсякденному лабораторної практиці.

У пропонованій вашій увазі статті узагальнені матеріали, які обговорювалися на семінарах фірми ЛЮМЕКС, деякі з них були опубліковані раніше. Автор висловлює надію, що висловлюваний матеріал буде корисний для фахівців, приступають до самостійної роботи з приладами капілярного електрофорезу, як у дослідному плані, так і для виконання рутинних вимірів.

Основи методу

Теоретичні основи капілярного електрофорезу досить складні, що обумовлене використанням в цьому методі властивостей поверхні розділу двох фаз - рідини і твердого тіла, властивостей в'язкості рідини і властивостей іонної електропровідності рідини, тому, не претендуючи на академічну строгість викладу, постараємося продемонструвати основні моменти методу капілярного електрофорезу.        

  

            

Рис. 1.   Схема процесів, що відбуваються на поверхні кварцу   

а)   ювенільний (свіжостворений) поверхня кварцу   

б)   освіта гідрофільних силанольних груп на поверхні кварцу   

в)   дисоціація гідрофільних силанольних груп у водному електроліті   

г)   гідратація утворилися іонів   

д)   зв'язування частини катіонів з поверхнею, формування подвійного   електричного шару     

Звернемося до процесів, що відбуваються на межі розділу двох фаз: внутрішній поверхні кварцового капіляра та водного розчину електроліту, що заповнює капіляр. На свежеобразованной (ювенільної) поверхні плавленого кварцу (SiO2) знаходяться головним чином силоксанових групи (рис. 1а). При контакті з парами води або водними розчинами силоксанових групи, що володіють подвійними зв'язками, виявляються нестійкими і, приєднуючи молекулу води, утворюють гідрофільних силанольних групи (рис. 1б). При контакті поверхні кварцу з водними розчинами, гідрофільних силанольних групи дисоціюють з відщеплення іонів Н + (рис. 1в). Ступінь дисоціації залежить від температури і складу водного розчину, зокрема від величини рН. При рН> 2,5 на поверхні кварцу утворюються дисоційованому гідрофільних силанольних групи, які створюють негативний поверхневий заряд.

дисоційованому іони, що знаходяться як на кварцовою поверхні, так і в об'ємі електроліту, гідратіруются (рис. 1г). За рахунок сил кулонівського взаємодії, гідратованих протилежно заряджені іони, що знаходяться на поверхні і в обсязі рідини, взаємно притягуються. Діючі при цьому сили настільки великі, що іони (частина катіонів і залишки гідрофільних силанольних груп) частково втрачають гідратірующую воду. У результаті цього, перший шар катіонів, безпосередньо що прилягає до поверхні, втрачає рухливість, зв'язується (рис. 1д). Оскільки "пухнасті" гідратованих катіони не можуть всі розміститися у вигляді монослоя і повністю компенсувати негативний заряд поверхні, деяка частина катіонів, що нейтралізують негативний заряд, відходить в товщу розчину і утворює заряд, розподілений в об'ємі рідини, що прилягає до кордону розділу і, в силу меншої енергії зв'язку з поверхнею, що володіє здатністю до переміщення (рис. 2а).        

            

Рис. 2.   Формування подвійного електричного шару (а) і   

хід   потенціалу на межі розділу кварц-електроліт (б)     

Незважаючи на сильне кулонівської взаємодії рекомбінації зарядів не відбувається. У результаті взаємодіючі системи зарядів утворюють подвійний електричний шар, що складається як би з двох ізольованих один від одного обкладок конденсатора, що мають заряди протилежного знака. Одну з обкладок складають негативно заряджені залишки гідрофільних силанольних груп, інші складаються з двох частин - нерухомого шару катіонів, що безпосередньо прилягають до поверхні кварцу, і дифузного шару, утвореного катіонами, що знаходяться в обсязі рідини. Розподіл катіонів між нерухомим і дифузним шарами, а, отже, і товщина подвійного електричного шару залежить в першу чергу від загальної концентрації електроліту в розчині. Чим вона вище, тим бo більша частина позитивного заряду дифузного шару переміщається в нерухомий шар і тим менше стає товщина дифузного шару (мал. 2б). При концентрації бінарного однозарядного електроліту 10-3 ... 10-4 М товщина подвійного електричного шару складає в середньому 30 ... 50 мкм.

звернемо (подумки) розглядається поверхню у вигляді труби з внутрішнім діаметром 50 ... 100 мкм, тоді виявиться, що практично вся рідина, що заповнює її, буде являти собою дифузну частина подвійного електричного шару. Трубу настільки малого діаметра прийнято називати капілярів. Якщо в такій системі уздовж осі капіляра прикласти електричне поле, то в капілярі виникне поздовжнє рух вільних носіїв електричних зарядів (різнополярних іонів) у взаємно протилежних напрямках, а оскільки в дифузної частини подвійного електричного шару присутня надмірна концентрація катіонів, то число іонів, які прямують до катода буде значно більше, при цьому їх рух буде захоплювати за собою всю іншу масу рідини в капілярі (внаслідок молекулярного зчеплення та внутрішнього тертя). Виникає так званий електроосмотіческій потік (ЕОП), направлений до катода, який буде здійснювати пасивний перенесення розчину всередині капіляра (рис. 3).        

            

Рис. 3.   Схема процесів в кварцовому капілярі. Стрілкою показано напрямок   електроосмотіческого потоку.     

Внаслідок цього процесу в електроліті, заповнює капіляр, виникає спрямоване переміщення маси рідини, що викликано прикладеною різницею потенціалів, при цьому вся маса рідини (за малим винятком приповерхневого шару) переміщається з однаковою швидкістю, тобто формується плоский профіль швидкостей. Це дуже важлива обставина, яка дозволяє отримати надзвичайно високу роздільну здатність методу, тому на нього треба звернути особливу увагу.

Технічна реалізація методу КЕФ

Мінімальний складу системи, що реалізує метод капілярного електрофорезу, повинен мати на своєму складі наступні компоненти: кварцовий капіляр, джерело високого напруги, пристрій введення проби, детектор і пристрій виведення інформації. Додаткові пристрої дозволяють автоматизувати подачу зразків, термостатіровать капіляр і зробити більш зручною обробку одержуваної інформації.

На рис. 4 представлена схема системи капілярного електрофорезу в простому випадку. Капіляр заповнюється розчином електроліту, своїми кінцями капіляр опущений у дві посудини, містять той же електроліт. Електроліт обов'язково повинен мати буферними властивостями, щоб, з одного боку, не допустити зміни складу розчину в пріелектродних просторах, а з іншого - стабілізувати стан компонентів проби в процесі аналізу. У судини введені електроди, до яких прикладається різницю потенціалів. Під дією різниці потенціалів в капілярі швидко встановлюється стаціонарний стан: через нього протікає електроосмотіческій потік (ЕОП), на який буде накладатися електроміграція катіонів і аніонів у взаємно протилежних напрямках.        

            

Рис. 4.   Схема системи капілярного електрофорезу     

Як правило, в приладах капілярного електрофорезу ЕОП направлений від вхідного кінця капіляра до детектора тому, при використанні кварцового капіляра, різниця потенціалів встановлюють таким чином, що вхідний кінець капіляра має позитивну полярність (анод), а детектор встановлюється поблизу катода. Якщо тепер в капіляр з боку анода ввести невеликий об'єм розчину проби, то ЕОП буде переносити зону проби до катода, і вона якийсь час буде знаходитися в капілярі під впливом електричного поля високої напруженості. Протягом цього часу компоненти проби, що мають заряди і відрізняються від компонентів робочого буфера, будуть пересуватися відповідно з властивими їм електричними рухливості, специфічними для кожного компонента. Катіонні компоненти проби, рухаючись до катода, будуть обганяти електроосмотіческій потік. Швидкість їхнього руху буде складатися з швидкості ЕОП і швидкості електроміграціі, тому на виході капіляра катіонні компоненти будуть з'являтися першими і тим раніше, чим більше електрична рухливість даного іона. Нейтральні компоненти проби будуть переміщатися тільки під дією ЕОП, і з'являться на виході, коли його досягне зона проби. Аніонні компоненти переміщуються до анода з різними швидкостями. Деякі з них, повільно мігруючі, будуть з'являтися поблизу детектора після виходу ЕОП, а ті, чия швидкість міграції за абсолютною величиною перевищує швидкість ЕОП, рано чи пізно вийдуть з капіляра в пріанодное простір.

Якщо час знаходження проби в капілярі (яку можна регулювати довжиною капіляра, швидкістю ЕОП або прикладеною різницею потенціалів) достатньо, то на виході капіляра поблизу катода формуються зони розчину, в яких знаходяться індивідуальні компоненти проби. Відбувається, таким чином, поділ вихідної суміші. Якщо тепер за допомогою детектора зареєструвати поява компонентів на виході з капіляра, то отримана запис буде називатися електрофореграммой і може служити основою для якісного і кількісного аналізу суміші. Описаний варіант аналізу носить назву капілярного зонного електрофорезу (КЗЕ). У цьому варіанті можуть визначатися катіонні компоненти проб і деякі повільно мігруючі аніони. Однак головні аніони, що визначають мінеральний склад води, зареєструвати такий спосіб неможливо.

Аналіз аніонів методом капілярного електрофорезу

Для того щоб методом КЗЕ можна було визначати аніонні компоненти проб, необхідно змінити полярність прикладається напруги. Однак у цьому випадку зміниться не тільки напрям міграції аніонів, а також напрямок ЕОП і він буде перешкоджати переміщенню у бік детектора повільно мігруючих аніонів. Для зміни напрямку ЕОП необхідно модифікувати поверхню кварцового капіляра таким чином, щоб знаки зарядів подвійного електричного шару помінялися на зворотні, і напрямок ЕОП збігалося з напрямком переміщення аніонів. Це досягається введенням в робочий буферний розчин катіонного поверхнево-активної речовини, наприклад, броміду цетілтріметіламмонія (ЦТАБ). Катіон ЦТАБ активно сорбується на кварцовою поверхні, займаючи при достатньою його концентрації, всі вакансії в найближчому до поверхні шарі. Поверхня як би "ощетінівается" довгими цетільнимі (С16Н33 - ) Ланцюжками. при подальшій промивці робочим буферним розчином поверхню сорбує ще один шар поверхнево-активної катіона, орієнтованого амонійний кінцем назовні (сорбція "щітка в щітку"). В результаті першого обкладка подвійного електричного шару стає позитивно заряженнной, а друге (у тому числі і дифузна її частина) здобуває негативний заряд, і тепер ЕОП знову переміщується в напрямку від вхідного кінця капіляра до детектора.

Аналогічними властивостями по модифікації поверхні капіляра володіють і інші буферні розчини, наприклад, виготовлений на основі 2 - [N-циклогексиламін] Етан-сульфоновой кислоти з модифікатором електроосмотіческого потоку в гідроксильної формі (тетрадецетілтріметіл амонію гідроксид) і т.п.

Детектування сигналів

У системах капілярного електрофорезу найбільш часто застосовується фотометричне детектування, в якому використовується один мулу кілька довжин хвиль, зазвичай лежать в ультрафіолетової області спектра. Відповідно відгук детектора буде спостерігатися тільки в тому випадку, коли визначається компонент має помітний поглинання на довжині хвилі детектування. Це - пряме детектування. Електрофореграмма буде представляти собою набір позитивних піків, що піднімаються над базовою лінією.

Однак, аніони, розчинені у воді, зареєструвати таким простим способом не вдається, тому що вони не мають власного поглинанням у вказаному спектральному діапазоні. У цьому випадку застосовується непряме детектування, суть якого полягає в тому, що ведучий електроліт готується з добавкою речовини, що поглинає світло на довжині хвилі детектування. У разі визначення аніонів добавка також повинна бути аніоном, наприклад, це може бути хромат-іон. Внаслідок того, що іонна сила провідного електроліту в процесі поділу залишається постійною, в зоні, де знаходиться непоглощающій іон, еквівалентно зменшується концентрація поглинаючого іона. У цьому випадку на електрофореграмме будуть спостерігатися зворотні (негативні) піки, площі яких пропорційні концентрацій визначаються іонів. Надалі, при комп'ютерній обробці результатів вимірювань, графік "перевертається" і набуває вигляду, зручний для розгляду, з позитивно розташованими піками.

Таким чином, варіант зонного капілярного електрофорезу з модифікацією поверхні капіляра і непрямим детектуванням дозволяє аналізувати компоненти, які в умови проведення аналізу знаходяться у формі аніонів.

Висновок

Зрозуміло, у рамках елементарного введення в метод, довелося піти на певні жертви і відмовитися від розгляду всього різноманіття прийомів і методик, які напрацьовані в хіміко-аналітичній практиці при використанні капілярного електрофорезу. Так, наприклад, для реєстрації сигналів у системах капілярного електрофорезу використовуються флуоріметріческіе детектори, детектори з використанням фотодіодних лінійок, мас-спектрометричні детектори і т.п. У якості аналітичних методів, крім капілярного зонного електрофорезу, використовуються міцелярно електрокінетіческая хроматографія, капілярна електрохроматографія, ізотахофорез, капілярний гель-електрофорез, капілярна ізоелектричної фокусування та ін

Список літератури

Для підготовки даної роботи були використані матеріали з сайту http://www.novedu.ru/